在分子生物學的研究當中,分子與分子之間的互作關系是極其重要的課題,而在這其中,蛋白質與 RNA 分子的互作則是為轉錄水平調控以及轉錄后調控創(chuàng)造了豐富的可能性。 

RIP-seq,全稱 RNA Immunoprecipitation Sequencing,該技術從一種已知的蛋白質出發(fā),使用針對該蛋白的特異性抗體將目標蛋白以及與其結合的 RNA 復合物沉淀下來, 進而對富集到的 RNA 進行分離和建庫測序,從而揭示 蛋白質-RNA 之間的結合關系。 

RIP-seq 擁有廣泛的應用場景,例如:通過針對 AGO2 蛋白的 RIP-seq,可以獲取參與 RNA 干擾以及 miRNA 海綿機制的相關 RNA 的信息;通過針對特定 RNA 修飾酶的 RIP-seq,可以知曉該 RNA 修飾酶的靶位點;通過針對特定 RBP(RNA 結合蛋白)的 RIP-seq,可以獲知 RBP 結合并調控的靶基因…… 由于其在分子機制研究上的出色表現(xiàn),RIP-seq 已經成為高分論文的利器。 

RIP 實驗的成敗是決定測序數(shù)據(jù)質量的關鍵因素。云序生物經過多年的經驗積累,自研開發(fā)了商業(yè)化的 Genseq RIP 試劑盒,為 RIP 實驗的成功率和穩(wěn)定性保駕護航。云序生物實驗室也承接 RIP-seq 以及 RIP-qPCR 業(yè)務,提供從樣品處理,文庫制備,上機測序到數(shù)據(jù)分析的一站式技術服務,助力復旦大學醫(yī)學院、上海交通大學醫(yī)學院、中科院上海植物生理生態(tài)研究所、華南農業(yè)大學動物科學學院在內的諸多研究機構的客戶發(fā)表了十余篇 RIP-seq 論文,其中不乏登上 Nature 子刊、Cell 子刊的高水平研究。

以下幾篇精彩案例不容錯過:

案例 1 

論文標題:Hypoxia regulates overall mRNA homeostasis by inducing Met1-linked linear ubiquitination of AGO2 in cancer cells

發(fā)表期刊:Nature Communications (IF=17.694)

作者單位:上海交通大學醫(yī)學院

樣品類型:人類 HeLa 細胞系

詳細解讀:RIP-seq項目文章|nature子刊揭示低氧誘導AGO2線性泛素化調控腫瘤發(fā)生發(fā)展機制 

miRNA 對 mRNA 的表達沉默作用需要 AGO2 蛋白的介導。在常氧和缺氧兩種環(huán)境下,作者針對 AGO2 蛋白進行了 RIP-seq 實驗,揭示了缺氧處理對 AGO2 結合的 mRNA 的影響。累積分數(shù)分析顯示,缺氧顯著降低了 mRNA 與 AGO2 的相互作用。通過包括 miRNA 測序在內的一系列后續(xù)實驗,作者發(fā)現(xiàn)缺氧誘導 AGO2 與 HOIP 以及 HOIL-1L 等的相互作用,它們與 miRNA 誘導的沉默復合物(miRISC)共定位,進而催化 AGO2 蛋白發(fā)生 Met1 殘基連接的泛素化(AGO2 M1-Ubi )。通過 RIP-seq 結果與 mRNA-seq  結果的比較,作者證實 AGO2 M1-Ubi 機制可以降低本應受 miRNA 調控的靶 mRNA 與 AGO2 的結合,從而造成 mRNA 的積累。 

案例 2

論文標題:Translational Regulation of Plant Response to High Temperature by a Dual-Function tRNAHis Guanylyltransferase in Rice

發(fā)表期刊:Molecular Plant (IF=21.949)

作者單位:中科院上海植物生理生態(tài)研究所

樣品類型:水稻種子

詳細解讀:云序客戶再發(fā)高分文章,教你如何玩轉tRNA機制研究

作者通過包括  tRNA-seq  在內的一系列實驗,發(fā)現(xiàn) tRNAHis 表達量的異常,進而發(fā)現(xiàn)一個 tRNAHis 的鳥苷酸轉移酶 AET1,它有助于 pre-tRNAHis 的修飾,并且對水稻在高溫條件下的正常生長不可或缺。作者隨后針對 AET1 蛋白進行了 RIP-seq,發(fā)現(xiàn)了 208 種 mRNA 在高溫條件下與 AET1 蛋白結合。RIP-seq 的聚類熱圖顯示植物生長素相關基因存在明顯的組間差異,其中 OsARF 基因最為明顯。作者隨后進行了 RIP-qPCR 驗證,確認了高溫環(huán)境下 AET1 蛋白與 OsARF 基因的主要開放閱讀框(mORF)以及上游開放閱讀框(uORF)均存在結合。作者隨后還進行了翻譯組水平的一些實驗,證明 AET1 通過 tRNA 影響水稻植物生長素信號相關蛋白的表達。這些發(fā)現(xiàn)為AET1通過在tRNA修飾和翻譯控制中發(fā)揮雙重作用來調控水稻的環(huán)境溫度反應的分子機制提供了新的見解。

 案例 3

論文標題:SUMOylation of YTHDF2 promotes mRNA degradation and cancer progression by increasing its binding affinity with m6A-modified mRNAs

發(fā)表期刊:Nucleic Acids Research(IF= 19.16)

作者單位:上海交通大學醫(yī)學院

樣品類型:人類肺癌細胞系

詳細解讀:云序客戶余健秀課題組m6A方向再次取得重大發(fā)現(xiàn)——SUMO化促進YTHDF2結合m6A修飾的mRNA影響癌癥進展

RNA m6A 修飾的閱讀蛋白 YTHDF2 在體內和體外的主要部位K571被SUMO化,它可以被缺氧誘導,而被氧化壓力和SUMO化抑制劑減少。YTHDF2的SUMO化對其泛素化和定位的影響不大,但會大大增加其與m6A修飾的mRNA的結合親和力,隨后導致基因表達的失調,這也是癌癥發(fā)展的原因。此外,來自TCGA數(shù)據(jù)集的肺腺癌患者的無病生存分析顯示,YTHDF2的高表達和SUMO1的高表達預示著不良的預后。此項研究揭示了YTHDF2識別m6A-RNAs的一個新的調節(jié)機制,并強調了YTHDF2的SUMO化在轉錄后基因表達調節(jié)和癌癥進展中的重要性。

案例 4

論文標題:The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript

發(fā)表期刊:Genome Biology(IF= 17.906)

作者單位:四川大學華西醫(yī)學院

樣品類型:人類卵巢癌細胞系

詳細解讀:叕一篇!云序客戶高分文章,教你如何巧用RIP測序玩轉分子機制!

本文揭示了RNA結合蛋白SORBS2在卵巢癌腫瘤細胞轉移過程中的重要生物學作用。從數(shù)據(jù)庫搜索,到通過RIP-seq鎖定SORBS2靶基因,RIP-seq 聯(lián)合全轉錄組測序的相關生物信息學分析提示SORBS2結合并穩(wěn)定部分轉錄本,其中WFDC1和IL-17D作為SORBS2結合的重要靶點可以抑制卵巢癌細胞的轉移灶的定殖。相關結果提出了一個全新的連接癌癥發(fā)展和免疫調節(jié)的轉錄后調控網(wǎng)絡,這一網(wǎng)絡依賴于SORBS2結合并穩(wěn)定轉錄本的重要生物學作用。

案例 5

論文標題:Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition

發(fā)表期刊:RNA Biology (IF= 4.766)

作者單位:華南農業(yè)大學動物科學學院

樣品類型:雞肝臟組織

詳細解讀:云序手把手教您如何應用RIP和RNA pull down技術——研究RNA分子互作機制沖擊高分文章

這篇文章主要研究circRNA Vav3通過吸附gga-miRNA-375促進雞肝癌的EMT過程,也是運用了RIP-PCR和RNA pull down-PCR實驗探究了circRNA Vav3能夠吸附gga-miRNA-375的機制

案例 6

論文標題:Attenuation of Piwil2 induced by hypoxic postconditioning prevents cerebral ischemic injury by inhibiting CREB2 promoter methylation

發(fā)表期刊:Brain Pathology(IF=7.611)

作者單位:廣州醫(yī)科大學

樣品類型:大鼠腦組織

詳細解讀:用戶文章,1區(qū) | 新型非編碼RNA piRNA測序揭示腦缺血神經損傷機制

作者在本文中描述了 Piwil2在通過表觀遺傳機制調節(jié) CREB2表達和介導大鼠 tGCI (短暫全局性腦缺血)后 HPC (低氧后處理)的神經保護中的作用。HPC 下調了 tGCI 后 CA1區(qū)域中 Piwil2的表達,作者通過針對 Piwil2 蛋白的 RIP +  piRNA-seq  發(fā)現(xiàn)了組間差異 piRNA 共同調控的基因:DNA 甲基轉移酶 DNMT3A。DNMT3A 反過來消除了 tGCI 誘導的 CREB2啟動子甲基化的增加,從而增加了 CREB2在 mRNA 和蛋白質水平。此外,HPC 誘導的 Piwil2的減少起到了恢復樹突復雜性和樹突長度的作用,并阻止了 CA1區(qū)域神經元樹突棘的喪失,從而改善了 tGCI 后大鼠的學習和記憶功能。

RNA免疫沉淀(RIP)技術介紹

01 RIP實驗原理

RIP技術(RNABinding Protein Immunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉淀),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,是了解轉錄后調控網(wǎng)絡的有力工具。運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析,結合的RNA可以通過定量PCR(RIP-PCR)或高通量測序(RIP-seq)方法來鑒定。

02 RIP-seq技術簡介

這種技術運用針對目標蛋白的抗體把相應RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析。RIP-Seq將RIP技術與高通量測序相結合,能夠高通量地檢測與特定蛋白結合的RNA,從而解析全轉錄組范圍內的目標蛋白-RNA相互作用網(wǎng)絡。云序生物是業(yè)內少數(shù)的既做前端高通量測序篩選,同時實現(xiàn)一站式解決功能機制的科研服務公司。在各RNA分子研究火熱的現(xiàn)階段,更多科研工作者想要在通過高通量篩選到目的基因后,解決RNA的分子機制問題,云序提供的RIP和RNA pull down技術正好解決分子機制的核心技術難點。

03 RIP試劑盒

GenSeq®RNA免疫沉淀試劑盒(RIP試劑盒),應用于RNA-蛋白質互作研究。通過RIP方法,可以檢測與特定蛋白結合的RNA,從而為研究分子機制提供強勢助力。優(yōu)化過的實驗流程后獲得的蛋白結合RNA可以廣泛應用于后續(xù)的定量RT-PCR,高通量測序以及其他檢測分析。

 云序生物服務優(yōu)勢 

優(yōu)勢一:一站式服務,客戶只需提供細胞,組織RIP后 RNA,云序生物為您完成從樣品處理,文庫制備,上機測序到數(shù)據(jù)分析整套服務流程。

優(yōu)勢二:商業(yè)化的RIP試劑盒RIP實驗的成敗是決定數(shù)據(jù)質量的關鍵,云序生物采用商業(yè)化RIP試劑盒,保證了RIP實驗的成功率和穩(wěn)定性。

優(yōu)勢三:嚴格的質控,云序生物在實驗的各個關鍵步驟加入了一系列質控點,全程監(jiān)控實驗質量,確�？蛻舻玫絻�(yōu)質的數(shù)據(jù)。

優(yōu)勢四:專業(yè)化的生物信息分析,云序生物具有強大的生物信息學團隊,能夠滿足客戶的各類深入數(shù)據(jù)分析要求。

相關產品 

根據(jù)已知分子和目標分子的不同,常見的蛋白質-RNA 互作研究的實驗方法有如下幾種類型:

RIP-seq

RNA-Pull Down

CO-IP

雙熒光素酶驗證Label free蛋白質譜TMT 蛋白質譜

RNA-seq

mRNA-seq

miRNA-seq

mRNA-qPCR

miRNA-qPCR

RIP試劑盒

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